IP免疫沉淀实验

免疫沉淀（IP）

免疫沉淀是根据抗原抗体结合原理、使用特异性的抗体以及protein A/G-coupled agarose beads从细胞或者组织裂解物标本中特异性纯化目的蛋白的方式。因为使用的是物理性性的分离办法，纯化后的蛋白可进一步进行其他实验和研究，如：WB。

免疫沉淀基本步骤：
制备细胞/组织裂解物  预纯化裂解物  免疫沉淀

第一步：制备细胞/组织裂解物
A：制备细胞裂解物
非变性方法：

将培养皿放在冰上，并用预冷的PBS洗涤细胞两次

倒掉PBS，加入预冷的细胞裂解液(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶). 

用预冷的细胞刮将细胞轻轻的刮下，然后将细胞悬浮液转移到预冷的离心管中

4℃，缓慢晃动20min（EP管插冰上，置水平摇床上）

4°C.离心，一般用12000rpm离心20分钟，但是要根据具体的细胞类型选择合适的离心速度和时间。

轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀

变性方法：

每 0.5-2 x 107 的细胞加入1ml变性裂解液.

用最大速度漩涡混匀细胞2-3s，将细胞悬液转移到新的epdoff管中. （此时由于DNA的释放，溶液可能很黏稠。）

95°C 加热5分钟

加入0.9ml非变性裂解液，轻轻混匀(非变性裂解液中的1% Triton X-100可以淬灭变性裂解液中的SDS)

用1ml针头注射器反复吸取裂解物5-10次以破碎DNA （重复这一机械破碎操作直到溶液比较清冽不太黏稠。.如果DNA没有被完全消化，会影响离心时上清和沉淀的分开。）

4°C.离心，一般用12000rpm离心20分钟，但是要根据具体的细胞类型选择合适的离心速度和时间。

轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀

B：制备组织裂解物

使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解

将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。

每5mg组织加入300ul裂解液，使用电子匀浆器将组织匀浆。

用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时

12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。

裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。

Note：如果要进行变性操作，则使用变性裂解液进行步骤3和4的操作

第二步：预纯化裂解物
        使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。
主要步骤：

每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时

加100 μl Preotein A/G agarose beads， 4°C缓慢摇动10-30分钟

14,000 x g 4°C离心10分钟 

取上清，弃沉淀

       为提高蛋白回收率，可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次，所得上清和前面的合在一起
Note：要确保最大可能将正常血清（或无关Ig）从标本中去除。

第三步：免疫沉淀

取10-500 μg细胞裂解物，加入推荐量的抗体：抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量，如果说明书没有推荐，也可以参考以下数据：.

多抗血清：1-5 μl

亲和纯化的多抗：1 μg

腹水（单抗）：0.2-1 μl

培养上清（单抗）：20 -100 μl

4℃缓慢摇动孵育1hr到过夜，取决于蛋白的量以及抗体的亲和力

同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠：根据抗体类型选择合适的beads（参考附表2），如果IP抗体是IgM：不使用protein-A/G beads，直接使用Goat anti Mouse IgM beads。

加入混匀的70-100ul protein-A/G beads，4℃缓慢摇动4hr（根据具体实验优化孵育时间)

2500rpm(约1000g) 4°C离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。

用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次，裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤3。

最后一次洗涤后，去除上清，加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液，95-100°C煮沸5分钟（将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来）。离心后取上清，弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。

        Loading buffer是最强力的洗脱液，所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来，这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液（up to 1 M）从抗体上洗脱下来。

附1：免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂
裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围 
Salts: 0-1 M
Detergent, non-ionic: 0.1-2%
Detergent, ionic: 0.01-0.5%
Divalent cations: 0-10 mM
EDTA: 0-5 mM
pH: 6-9
1. 非变性裂解buffer：
适用于抗原类型：可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别
20 mM Tris HCl pH 8
137 mM NaCl
10% glycerol
1% Nonidet P-40 (NP-40)
2 mM EDTA
4°C 可保存6个月
使用前加入：Protease inhibitors
上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代
2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer
含有更强的变性剂，特别适用于核蛋白的提取。
50mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。
3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer（Detergent-free soluble protein lysis buffer）：
一些可溶性蛋白不需要使用去污剂，只要使用该buffer配合机械性的破碎操作即可：如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作
含有以下成分的PBS：
5 mM EDTA
0.02 % Sodium Azide
4°C 可保存6个月
使用前加入：Protease inhibitors
4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer: 
有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解buffer，然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白
1% SDS
5 mM EDTA
室温可保存1周
使用前加入：Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase1
5、其它所需试剂：
蛋白酶抑制剂Protease inhibitors ：推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail，也可使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml).
无菌PBS pH 7.4
无菌PBS-BSA 1% (过滤处理)
TBST缓冲液
WB上样buffer

附2：免疫沉淀所用Beads类型选择指南: