(一)蛋白质电泳 1.请参照常规电泳操作. 2.分子量标准: 可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点: 优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率. 缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力. 购买信息: 中范围蛋白质分子量标准(14.3-97.4KD) | V5235S | 200μg | 国产 | 80元 | 分子量大小:（14.3、21.5、31、40、42.7、55、66.2、97.4KD） | 中范围蛋白质分子量标准(24-97KD) | MTB087-1 | 20次 | 国产 | 80元 | 分子量大小:（24、36、53、66、97KD） | 低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD） | M3913-1 | 20次 | Sigma | 280元 | 低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD） | M3913-1 | 5×20次 | Sigma | 1198元 | 分子量大小:（6.5、20、24、29、36、45、66KD） | 高范围蛋白质分子量标准（36-205KD) | M3788-1 | 20次 | Sigma | 280元 | 高范围蛋白质分子量标准（36-205KD) | M3788-1 | 5×20次 | Sigma | 1198元 | 分子量大小:（36、45、55、66、84、97、116、205KD） | 宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD) | M4038-1 | 20次 | Sigma | 280元 | 宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD) | M4038-1 | 5×20次 | Sigma | 1266元 | 分子量大小:（6.5、14.2、20、24、29、36、45、55、66KD） | 预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD) | | 20次 | 自产 | 320元 | 预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD) | | 50次 | 自产 | 680元 | 分子量大小: 80, 60, 39, 23, 18 kDa | 预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD) | | 20次 | 自产 | 320元 | 预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD) | | 50次 | 自产 | 680元 | 分子量大小:210, 140, 106/102, 80, 52, 20 kDa | 预染的中高范围蛋白质分子量标准(18.3-210KD) | 26681 | 48次 | Pierce | 1214元 |
(二)蛋白质转印 a) 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下: | NC膜 | PVDF膜 | 物理强度 | 差 | 好 | 蛋白质结合能力 | 80-100ug/cm2 | 100-200ug/cm2 | 溶剂耐受力 | 无 | 有 | 考马斯亮兰染色 | 否 | 可以 | ECL检测 | 稍差 | 可以 | 快速免疫检测 | 否 | 可以 | SDS存在下蛋白质结合 | 差 | 好 | 质谱分析 | 否 | 可以 |
(尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交) b) 膜的大小: 请根据胶的面积来确定. c) 膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质. 购买信息: 66485 | 硝酸纤维素膜,0.45um,30cmX3m/卷 | 美国Gelman | 1395元/卷 | | 硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm | 美国Gelman | 80元/张 | | 硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm | 国产 | 30元/张 | 60207 | 尼龙膜, 0.45um,30cmX3m/卷 | 美国Gelman | 2310元/卷 | | 尼龙膜, 0.45um,20cmX15cm | 美国Gelman | 90元/张 | | 尼龙膜, 0.45um,直径100mm,50张/盒 | 国产 | 260元/盒 | 66543 | PVDF膜, 0.45um,30cmX3m/卷 | 美国Gelman | 1690元/卷 | | PVDF膜, 0.45um, 直径100mm,50张/盒 | 国产 | 260元/盒 |
(三) 蛋白质的显示(大部分实验不需要进行此步操作) 蛋白质染色的染料有很多种,各种的特点均不一样. | 蛋白质灵敏度 | 影响免疫检测 | Ponceau-S Red丽春红 | 5ug | 无 | 快绿Fc | 5ug | 无 | Sypro Rose | 1-2ng | 无 | 氨基黑10B | 1ug | 有 | 考马斯亮兰R-250 | 500ng | 有 | 印度墨 | 100ng | 有 | 胶体金 | 4ng | 有 |
购买信息: Ponceau-S Red丽春红 | Sigma原装 | 10g | 182元 | 快绿Fc | Amresco分装 | 25g | 258元 | 氨基黑10B | Sigma分装 | 10g | 168元 | 考马斯亮兰R-250 | Amresco分装 | 10g | 168元 | 蛋白银染试剂盒 | 自产MTB083-1 | 10次 | 188元 | SDS-PAGE蛋白快速染色试剂 | 自产 | 25次 | 100元 | Western Blot 膜可逆染色剂 | 自产 | 100ml | 100元 |
(四)免疫检测 有各种不同的免疫检测方法.请注意选择.方法不同,则所需的试剂也不同.如需方便,可选择完整的试剂盒. A.封闭膜: 这一步会影响结果的成败和背景的强度.常用封闭剂为BSA和Tween20. 脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体. 购买信息: 牛血清白蛋白组份五BSA | Amresco分装 | 25g | 280元 | Tween 20 | Amresco分装 | 500ml | 150元 | Western Blot 膜封闭剂 | 自产 | 100ml | 100元 |
B.一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测,必须采用非变性胶电泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原装抗体或进口分装抗体.具体请参见免疫学部分产品----第一抗体. C.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗. 购买信息: 请参见免疫学部分试剂---各种标记抗体 D.底物系统: 采用常规底物或化学发光底物. (1) 显色法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单,但灵敏度不高,并难以从膜上去除. (2) 化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高,检测时可采用X光胶片或CCD成像系统. 不同显色方法产品比较如下: | 厂家 | 灵敏度 | 方法 | SuperSignalâ West Pico 化学发光底物 | 美国Pierce | 皮克级 | 化学发光法 | SuperSignalâ West Dura 持久性化学发光底物 | 美国Pierce | 低飞克级 | 化学发光法 | SuperSignalâ West Femto 高灵敏度化学发光底物 | 美国Pierce | 飞克级 | 化学发光法 | ECL Kit | Amersham | 飞克级 | 化学发光法 | BCIP/NBT (AP酶) | | 100pg | 显色法 | DAB (HRP酶) | | 100pg | 显色法 |
推荐产品: SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液 采用独特的发光底物系统，是世界上最灵敏的ECL Western Blot 化学发光试剂。用于Western Blotting 条带的荧光发光，检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP 的抗体及其关联的抗原。由两种溶液组成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏发光液，价格低廉，灵敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同类ECL 产品100 倍以上，也明显高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化学发光系统数倍，但背景更干净，发光时间持久，可以长达10 小时以上。 特别适用于丰度极低而一般ECL 系统难于检测的目的蛋白。 特点如下： ж 灵敏度极高，可检测10-100 fg 抗原。 ж 高信噪比，背境干净。 ж 发光迅速。 ж 发光持续12小时以上。 ж 可在日光灯下进行发光操作。 ж 节省抗体(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。 ж 储存条件：4℃避光储存一年，偶尔室温放置数周不影响质量。 购买信息 产品名称 | 规格 | 编号 | 价格 | SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液 | 10ml | P1010-10 | 138 | 25ml | P1010-25 | 266 | 100ml | P1010-100 | 880 |
美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列 SuperSignalâ 底物家族提供一系列的底物，适合免疫印迹的多种灵敏度要求。 | | SuperSignalâ West Pico化学发光底物 | SuperSignalâ West Dura 持久性化学发光底物 | SuperSignalâ West Femto Maximum Sensitivity Substrate | 更低检测极限(克) | 10-12 | 10-14 | 10-15 | 建议抗体稀释度 | 一抗：1/1,000-1/5,000 | 一抗：1/1,000-1/50,000 | 一抗：1/5,000-1/100,000 | 二抗：1/20,000-1/100,000 | 二抗：1/20,000-1/250,000 | 二抗：1/100,000-1/500,000 | 信号持续时间 | 6-8小时 | 24小时 | 8小时 | 工作溶液稳定性 | 室温24小时 | 室温24小时 | 室温8小时 | 贮藏液存放时间 | 室温1年 | 室温1年 | 室温6个月或4°C一年 | 推荐印迹膜 | 硝化纤维 | 硝化纤维或PVDF | 硝化纤维或PVDF |
| SuperSignal@West Pico 化学发光底物 | 特征 优点 | 经济：比任何其它化学发光底物产品花费更少。 更长发光时间：强光发射超过一个工作日，获得你想要曝光次数。 高强度：信号比其它基于发光胺的系统强两倍。 皮克级灵敏性：高度灵敏性可快速显色较宽水平范围内的蛋白质。 优良的稳定性：24小时工作溶液稳定性；在运输条件环境下至少可稳定1年。 | SuperSignal@ West Dura 持久性化学发光底物 | 特征 优点 | 24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物提供的要长10倍；为发表质量的印迹提供更多的曝光 极好的灵敏度：具前所未有的10-15克级灵敏度 节省抗体：使用Super Signal âWest Dura 伸展持续期底物比用其它化学发光底物，抗体稀释度可高得多。 立即产生强烈信号，易被胶片或化学发光检测系统检测 工作浓度至少稳定24小时；试剂盒在运输条件下可稳定至少一年 | SuperSignal@ West Femto 最高灵敏度化学发光底物 | 特征 优点 | 释放由化学发光系统产生的最强信号；使胶片或图象仪系统成像更容易达到可能检测蛋白质的最低限：10-15克 经济：使宝贵的一抗稀释度可达1/100,000 | Lumi-PhosTM West Blotting 化学发光底物 | PIERCE 基于碱性磷酸酶检测系统的化学发光底物，其同时具有两个特色：高强度信号和较低的背景。 |
定货信息 目录号 | 产品名称 | 包装 | 价格 | SuperSignalâ West Pico化学发光底物 | 34080 | SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate | 500ml | 2178 | 34077 | SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate | 100ml | 647 | 34079 | SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate Trial Kit | 50ml | 383 | SuperSignalâ West Dura持久性化学发光底物 | 34075 | SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate | 100ml | 3643 | 37071 | SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate Trial Kit | 20ml | 805 | SuperSignalâ West Femto最高灵敏度化学发光底物 | 34095 | SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate | 100ml | 3828 | 34094 | SuperSignal® West Femto Maximum Substrate Trial kit | 20ml | 950 |
4. Western Blotting检测试剂盒 我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可以避免各种试剂的不匹比而带来的结果不理想. Western Blotting DAB显色法检测试剂盒 试剂盒的内容： （1） 封闭试剂：10g蛋白质干粉2包。 （2） 浓缩抗体稀释液：20ml×2瓶，为10倍浓缩液。 （3） 过氧化物酶标记二抗。1ml。效价1：200—400 （4） DAB浓缩液10ml(×40倍) 购买信息: Western Blotting DAB显色kit（大鼠IgG） | SA2023 | 国产 | 盒 | 550元 | Western Blotting DAB显色kit（山羊IgG） | SA2021 | 国产 | 盒 | 550元 | Western Blotting DAB显色kit（兔IgG） | SA2022 | 国产 | 盒 | 550元 | Western Blotting DAB显色kit（小鼠IgG） | SA2020 | 国产 | 盒 | 550元 | SuperSignal West Pico His蛋白Western检测试剂盒 | 15168 | Pierce | 盒 | 3268元 | CL-Xposure X 光胶片(5”x7”) | 34090 | Pierce | 100张 | 1054元 | CL-Xposure X 光胶片(8”x10”) | 34091 | Pierce | 100张 | 2121元 | 柯达X 光胶片(5”x7”) | | 合资 | 100张 | 200元 | 暗盒(5”x7”) 含增感屏 | | 国产 | | 650元 | 显影粉 | | 国产 | 瓶 | 8元 | 定影粉 | | 国产 | 瓶 | 8元 |
注: 每盒足够10张膜或800平方厘米的膜显色, 表中所列动物IgG是指一抗的种属来源.
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